荧光染色背景太强有哪些成因？如何避免？

荧光显微镜相比普通光学显微镜有高特异性、高灵敏度等优势，是现代实验室必不可少的工具，而使用荧光显微镜成像拍照，最怕的就是出现高强度的荧光染色背景，因为这会降低成像信噪比，导致样品信号不清晰、细节丢失。那么荧光染色背景太强有哪些成因呢?又如何避免呢?

·环境光导致的背景荧光

环境光导致荧光显微镜背景荧光增强是很常见的情况，因为环境光没有经过激发滤光片的过滤，所以有可能包含激发光在内的各种波长光，这可能会带来额外的背景荧光和杂散光。

很多老师会用暗室成像，或用衣服/遮光罩把荧光显微镜遮光来成像，这对降低一些背景荧光和杂散光是有积极意义的，有条件可以参考。

·透射聚光镜导致的背景荧光

目前使用的荧光显微镜主要是落射荧光显微镜，也就是说，荧光激发光从物镜出来，照射样品，然后发射光回到物镜成像。由于样品玻片是透明的，因此激发光穿过样品后还会进入透射光路的聚光镜，再反射并聚光回样品上，形成强背景荧光。

我们以升级荧光观察的正置显微镜蔡司PrimoStar3和倒置显微镜徕卡DMIL为例，给大家介绍如何解决这个问题。

首先是正置显微镜蔡司PrimoStar3，在进行调整前，有非常强的同色背景荧光，导致样品信号比较难分辨。

由于聚光镜有锁定限位，所以需要先解锁。解锁后，下调聚光镜到最低高度。

把聚光镜光阑收到最小，或把黑卡纸、牛皮纸之类不反光的纸片，插到聚光镜顶部和载物台之间。

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可以看到背景荧光得到了大幅改善，这个信噪比足够后期把背景荧光处理掉了。

倒置荧光显微镜DMIL方面，在进行调整前，有偏红的背景荧光和杂散光出现，影响成像纯净度。

由于倒置显微镜无法调节工作高度，也不方便放置遮光板，因此可以做最简单的操作，把聚光镜的孔径光阑收到最小，光阑的叶片会阻挡发射光透过，就避免了额外的背景荧光。

孔径光阑收小之后，偏红的背景荧光就消失了，样品信噪比得到了改善。

·来自样品、器皿和介质的背景荧光

上述两种背景荧光，都不会因为样品移动而变化，如果样品移动背景荧光也有变动，那么问题可能就出在样品、器皿或者介质，需要针对性处理。

比如样品有未结合的染料，需测试优化合适的荧光染料浓度，并在样品处理时使用PBS多漂洗几次，去除未结合的染料。

如果样品有自发荧光造成干扰，可能需要尝试其他通道的染料进行标记，另外塑料器皿也可能有背景荧光，最好使用无荧光的玻璃器皿。

如果使用多孔板，可以设置一些不带样品的对照孔来获取背景荧光强度信息，方便后期处理时可以把背景荧光扣除掉。

免疫荧光标记的固定细胞成像，如果出现背景荧光问题，需要检查封片剂，高倍观察的话还要注意镜油是否为无荧光镜油。